外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天；一类是稳定表达（构建稳转株），外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。

建立稳定细胞株，基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，筛选得到可稳定表达目的蛋白、或稳定沉默特定基因的细胞株。

慢病毒感染筛选稳定细胞株

利用慢病毒整合表达特性来筛选稳定细胞株，该方法克服了传统质粒挑单克隆方法周期久的弊端，可以在短时间内高效获取稳定细胞株。

利用慢病毒制备稳定株优势

• 细胞适用种类广泛，可用于各种哺乳动物细胞；
• 构建稳转株时间短，表达持续时间长；
• 多种荧光标记和抗性基因可选，满足观测实验要求。

HUVEC

HepG2

混合克隆稳定细胞株:

• 混合克隆细胞系是基因转染后直接用抗药筛选得到的，筛选出的细胞都表达抗性基因和目的基因，但包含了各种不同的细胞克隆。不同克隆的目的基因整合位置和表达量均有所不同。
• 混合克隆细胞株筛选比较快速，费用较低。在需要构建的细胞株转染效率高，目的基因表达效率高的情况下，单克隆细胞株最后得到的表达效果和混合克隆细胞株并没有显著差异，这时多克隆细胞筛选是理想的选择。

单克隆稳定细胞株:

• 单克隆细胞系是由含有稳定整合外源片段的单个细胞的扩增得到的细胞株，每个细胞的目的基因整合位置的表达量均高度一致，但可能丢失一些表型。单克隆细胞株筛选周期长，费用高。需要进行细胞亚定位实验的细胞系，难感染的和表达率低的通常建议进行单克隆细胞筛选。

• 客户提供

  • 目的基因名称，种属等信息
  • 载体需求（抗性、荧光、便签等）
  • 目的细胞等信息
  • 其它特殊需求

• 安震服务

  • 细胞预实验
  • 质粒构建表达检测
  • 慢病毒包装与纯化
  • 稳定株筛选及鉴定

• 客户所得

  • 构建好的稳定株
  • 构建好的稳定株
  • 构建的质粒，病毒等

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）/Cas9是细菌和古细菌在长期进化而形成的一种适应性免疫防御机制，CRISPR/Cas9系统可以用于各种基因组的编辑。CRISPR/Cas9系统会通过小导向RNA(sgRNA)对切割区域进行识别，并利用Cas9内切酶实现在识别位点中间预测的位置切割，造成DNA双链断裂，在细胞进行易错修复后造成随机的突变。CRISPR/Cas9系统其突变效率高、灵活简单，周期短，成本低，已经被广泛的应用于基因编辑的研究。CRISPR/Cas9系统应用最多的领域是基因敲除株系构建和基因敲除动物的研究。

公司可提供项目服务包括：CRISPR/Cas9实验方案设计、CRISPR/Cas9基因敲除载体构建、CRISPR/Cas9基因敲除载体病毒包装、CRISPR/Cas9基因敲除细胞株构建

CRISPR/Cas基因组编辑原理

• 定制特定基因敲除细胞系只需提供基因名称
• 快速获得有效sgRNA，基因编辑效率高
• 实验周期短
• 可根据需要提供CRISPR/Cas9慢病毒包装服务

1. 靶向目的序列sgRNA的设计、载体构建及活性验证

2. 目的细胞系共转染，初步筛选混合克隆

3. 铺单克隆，单克隆筛选及鉴定细胞基因型

4. 阳性细胞株的扩增

构建稳定细胞系的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，常用G418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。

慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，因此，慢病毒常用于制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株。

安震生物制备的带puromycin抗性的慢病毒，在感染目的细胞后，可通过加入puromycin进行选择性筛选，从而获得稳定表达shRNA或者特定基因的细胞株。

• 构建细胞模型，用于后续基因功能研究和基因治疗研究等
• 适用于体内实验，用于裸鼠成瘤
• 用于药物靶筛选、细胞信号传导通路分析及蛋白质相互作用等

1. 过表达慢病毒构建与包装；

2. 慢病毒包装/扩增；

3. miRNA慢病毒。